GLP-1(veza:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) je polipeptidni hormon koji se sastoji od 30 aminokiselina. Uz dubinsko istraživanje GLP-1, razvijeno je sve više sintetičkih metoda. Ovaj članak će sistematski predstaviti trenutno poznate metode sinteze GLP-a-1.
Metoda 1, sinteza čvrste faze:
Sinteza na čvrstoj fazi je široko korištena metoda za sintezu peptida i proteina, a također se često koristi za sintezu GLP-1. U sintezi u čvrstoj fazi, struktura jezgra se formira povezivanjem prve aminokiseline sa smolom. Zatim se sljedeća aminokiselina dodaje u nizu i kemijski reagira s odgovarajućim kondenzirajućim sredstvom. Konačno, ciljni proizvod se može dobiti cijepanjem polipeptida od smole.
Važnost sinteze u čvrstoj fazi je u tome što omogućava automatizaciju i masovnu proizvodnju sinteze peptida. Trenutne glavne metode sinteze u čvrstoj fazi uključuju Fmoc i Boc. Među njima, Fmoc metoda koristi N-Fmoc zaštitnu grupu za zaštitu peptida, dok Boc metoda koristi terc-butiloksikarbonil za zaštitu karboksilne grupe.
Metoda dva, sinteza tečne faze:
Sinteza u tečnoj fazi je tradicionalna metoda sinteze peptida u kojoj se reaktanti stavljaju u tečnu fazu za reakciju. Prednost sinteze u tečnoj fazi je u tome što su reakcioni uslovi blagi i pogodni za modifikaciju osetljivih hemijskih struktura. Međutim, zbog previše reaktanata, proces prečišćavanja je relativno težak. Hemijske reakcije u sintezi tečne faze uključuju:
1. Reakcija kondenzacije:
Reakcija kondenzacije je jedna od najosnovnijih reakcija u sintezi peptida, odnosno karboksilna grupa koju iniciraju kondenzatori kao što su DCC i HOBt je povezana sa amino grupom aminokiseline reakcijom acilacije. Uslovi reakcije su blagi, a prinos je visok.
2. Reakcije eliminacije:
Reakcija eliminacije je redukcija metionina u ditiol pomoću NaBH4 i drugih redukcijskih agenasa, čineći ga neaktivnim. Reakcija se mora izvesti pod osnovnim uslovima.
3. Uklanjanje zaštitnih grupa:
Zbog različitih funkcija aminokiselina u peptidnom lancu, za zaštitu će se koristiti različite zaštitne grupe. Nakon što je sinteza završena, zaštitnu grupu treba ukloniti. Za Fmoc metodu, piperidin se obično koristi za uklanjanje Fmoc; dok se za Boc metodu, TFA koristi za uklanjanje Boc.
Treći metod, hemijska sinteza:
GLP-1 je polipeptidni hormon sa važnim biološkim aktivnostima. Njegova sinteza se može realizovati raznim metodama, među kojima je hemijska sinteza jedna od najčešće korišćenih metoda. Prednost kemijske sinteze je u tome što može proizvesti visoko čiste ciljne proizvode, koji su pogodni za proizvodnju velikih razmjera. Metoda hemijske sinteze i detaljni koraci GLP-1 bit će predstavljeni u nastavku.
1. Sintetička ruta i odabir zaštitne grupe:
GLP-1 molekul se sastoji od 36 aminokiselina, uključujući 21 L-tipa i 15 D-tipa aminokiselina. Prije izvođenja sinteze potrebno je odabrati odgovarajući sintetički put i odabrati odgovarajuću zaštitnu grupu prema sintetičkim uvjetima. Fmoc sinteza u čvrstoj fazi se obično koristi za automatiziranu sintezu velikih razmjera. Ova metoda koristi N-9-fluoroimido karboksilnu zaštitu (N-Fmoc) kao zaštitnu grupu, a također treba odabrati odgovarajuću sekundarnu zaštitnu grupu (kao što je terc-butil ili metil) kako bi se osigurala zaštita određenih mjesta. Svaki put kada se doda nova aminokiselina, potrebno je prvo ukloniti Fmoc zaštitnu grupu, a zatim se dodati zaštićena spojna tvar sljedeće amino kiseline.
2. Sinteza osnovne aminokiselinske sekvence:
Osnovna sekvenca GLP-1 sastoji se od 21 aminokiseline, uključujući ključnu sekvencu serina i četiri dipeptidne sekvence prolil-glutaminske kiseline. U sintezi na čvrstoj fazi, sinteza jezgrenog niza može se podijeliti na sljedeće korake:
2.1. Dodajte karbamat octene kiseline (Fmoc-NH-CH2CO2Et) i 2-Cl-Trt-Cl u čvrstu fazu sintetičke smole i izvršite reakciju kondenzacije sa sredstvom za spajanje DIC/NMM.
2.2. Uklonite Fmoc zaštitnu grupu uklanjanjem zaštite grupne reakcije.
2.3. Dodajte sljedeću aminokiselinu, ponovite korak 1 i korak 2 u nizu dok se ne sintetizira jezgra sekvence.
2.4. Formiranje pentapeptidnih struktura na smoli u čvrstoj fazi. Dodajte reagens za acetalizaciju u smolu u čvrstoj fazi, reagirajte sa sredstvom za prepoznavanje N-terminala (kao što je HBTU), dodajte zaštitnu grupu bočnog lanca serina kao pomoćno redukcijsko sredstvo, a zatim uklonite zaštitnu grupu Fmoc.
2.5. Pod katalizom Bacillus subtilis transferaze (ProTide), struktura pentapeptida prolazi kroz reakciju izmjene sa prekursorom serin jodoacetata.
3. Sinteza preostale sekvence aminokiselina:
Nakon završetka sinteze jezgrene sekvence, potrebno je nastaviti sa dodavanjem preostalih aminokiselina, uključujući aminokiseline L- i D-tipa. Dodavanje ovih aminokiselina treba početi od jezgrene sekvence, dodati sljedeću aminokiselinu u nizu i koristiti odgovarajući kondenzacijski agens za izvođenje hemijskih reakcija dok se ne sintetiše kompletan GLP-1 polipeptidni molekul. Tokom ovog procesa, potrebno je i odabrati odgovarajuću zaštitnu grupu prema potrebi, te izvršiti korake reakcije, uklanjanje zaštitne grupe i dodavanje aminokiseline u nizu.
4. Tretman natrijum hidroksidom:
Nakon što se dodaju sve aminokiseline, na smoli u čvrstoj fazi formira se nepotpuno sintetizirani peptidni lanac i treba ga obraditi da bi se formirao potpuno formiran peptidni molekul. Prvo, neformirani peptid treba hidrolizirati natrijum hidroksidom, tako da se C-terminalna karboksilna grupa prvobitno vezana za smolu odvoji od smole, a zaštitna grupa se odvoji u vodi. Nakon reakcije hidrolize, dobije se ciljni produkt.
5. Padavine i pranje:
Nakon tretmana, hidrolizirana otopina se tretira kiselinom kako bi se istaložio ciljni produkt. Zatim je pelet resuspendiran u vodi, nakon čega je uslijedilo intenzivno pranje kako bi se uklonile nečistoće.
6. Pročišćavanje:
Završni korak je pročišćavanje željenog proizvoda, obično korištenjem tečne hromatografije visokih performansi. Tokom ovog procesa, čistoća proizvoda može se odrediti detekcijom vrha rastvora u spektru mase. Ukratko, hemijska sinteza GLP-1 zahtijeva više krugova složenih reakcija i strogih procesa prečišćavanja da bi se konačno dobio aktivni ciljni proizvod.
Metoda četiri, biosinteza:
GLP-1 je važan polipeptidni hormon sa različitim fiziološkim efektima, uključujući promicanje lučenja insulina, suzbijanje apetita, smanjenje tjelesne težine i održavanje osjetljivosti na inzulin, itd. Metoda biosinteze GLP-1 uglavnom se sintetizira od L ćelija u pankreasu, a brzina njegove sinteze se reguliše unosom hranom. Detaljni koraci su predstavljeni kako slijedi:
1. Pripremni radovi prije sinteze:
Prije biosinteze GLP-1, potrebno je obaviti neke pripremne radove, uključujući određivanje korišćenog tipa ćelije, postavljanje uslova kulture i odabir odgovarajućeg katalitičkog enzima. L ćelije su glavni izvor sinteze GLP-1 jer sadrže prekursore dva hormona, GIP (peptid sličan glukagonu 1) i GLP-1. L ćelije se mogu izolovati iz intestinalnog epitela zečeva ili miševa. Prije biosinteze, ćelije se moraju uzgajati u dovoljnom broju, te treba obezbijediti dovoljno hranljivih materija i pogodne uslove za uzgoj. Osim toga, potrebno je odabrati odgovarajući katalitički enzim za poticanje reakcije.
2. Sinteza i obrada prekursora:
Biosinteza GLP-1 uglavnom se dešava u L ćelijama, a njegov prekursor se sastoji od dva hormona, GIP i GLP-1. Nakon ulaska u endokrine ćelije, GIP i GLP-1 se obrađuju proteolitičkim enzimima i cijepaju u pojedinačne peptide. Niz enzima i kofaktora je uključen u ovaj proces, uključujući prekursor polipeptid acidazu (PC2), izomerazu i faktore kasne adhezije.
3. Međusobna konverzija između polipeptidnih segmenata:
Nakon obrade, GIP i GLP-1 peptidi se rekombinuju da formiraju GLP-1 polipeptid. Ovaj proces zahtijeva upotrebu peptida sličnog glukagonu 1 (GLP-1) kao šablona na koji se kombinuju drugi pojedinačni peptidi kako bi se formirali novi kompozitni polipeptidi. Ovaj proces takođe zahteva neke specifične enzime i faktore, uključujući prohormon konvertazu 1/3 (PC1/3) i karboksipeptidazu E (CPE).
4. GLP{1}} lučenje:
Nakon što se GLP-1 sintetiše i obradi, pohranjuje se u citoplazmi i unutrašnjim vezikulama endokrinih ćelija. Kada su stimulirane prehranom, endokrine ćelije oslobađaju GLP-1 i ulaze u krvotok kroz mikrožile. Ovaj proces je reguliran i kontroliran kroz niz puteva prijenosa signala, uključujući cAMP-Ca2 plusi tako dalje.
Ukratko, biosinteza GLP-1 uključuje zajedničko djelovanje više veza i faktora. Kombinacija biosinteze i hemijske sinteze može pružiti bolju osnovu i podršku za istraživanje i proizvodnju GLP-1.
Peta metoda, enzimska sinteza:
Enzimska sinteza je sinteza peptidnih lanaca katalizom bioloških enzima. U poređenju sa tradicionalnim metodama sinteze u tečnoj fazi, enzimska sinteza se može izvesti na sobnoj temperaturi i može se odabrati širok spektar sirovina. Enzimi kao što su theta-liquid sintaza, AEP, ACE, itd. obično se koriste za katalizaciju sinteze.
U zaključku, gore navedene metode su izvodljive metode za GLP-1 sintezu. Različite metode su pogodne za različite eksperimentalne uslove i okruženja farmaceutske proizvodnje.