L-tioglutaminska kiselinaje prirodni proizvod koji se pretvara iz prekursora sličnih glukozinolatu u grannymonda povrću kao što su kelj, senf i brokula. Ima niz zdravstvenih efekata i široko se koristi za prevenciju hroničnih bolesti kao što su rak, kardiovaskularne bolesti i dijabetes. Široko se nalazi u biljkama krstaša, kao što su kelj, karfiol i kupus. Ima mnogo farmakoloških aktivnosti, kao što su antikancerogeno, antiinflamatorno, antioksidativno, neuroprotektivno, itd. Stoga je sintetička metoda L-tioglutaminske kiseline privukla veliku pažnju.
Trenutno se metode za sintezu L-tioglutaminske kiseline mogu podijeliti u dvije kategorije: biološka fermentacija i hemijska sinteza. Ove dvije metode su detaljno opisane u nastavku.
Metoda biološke fermentacije L-sulforafana:
Metoda biološke fermentacije je metoda sinteze spojeva s mikroorganizmima. Kroz skrining bakterijskih sojeva i optimizaciju uslova kulture, mikroorganizmi mogu proizvesti L-tioglutaminsku kiselinu tokom procesa fermentacije. Sada je otkriveno da mnogi sojevi mogu sintetizirati L-tioglutaminsku kiselinu, kao što su Escherichia coli, Streptococcus thermophilus i tako dalje. Među njima je najčešća metoda za sintezu L-tioglutaminske kiseline sojevima koje predstavlja Escherichia coli. Specifični koraci su sljedeći:
1. Izolujte sojeve koji proizvode L-tioglutamat, kao što je Escherichia coli, iz tla ili biljnog tkiva;
2. Usvojiti odgovarajući medijum i uslove kulture, kao što su temperatura, pH vrednost, vreme kulture, itd., za kultivaciju Escherichia coli;
3. Sakupite fermentacionu juhu Escherichia coli, izvršite određenu obradu i prečišćavanje i dobijete L-tioglutaminsku kiselinu.
Metoda hemijske sinteze L-sulforafana:
Metoda kemijske sinteze je korištenje metode kemijske molekularne reakcije za sintezu L-tioglutaminske kiseline različitim sintetičkim putevima. Trenutno su metode kemijske sinteze uglavnom podijeljene u četiri tipa: metoda soli holina, metoda sulfuril hlorida, metoda redukcije karbonila i metoda agaroznog sulfata.
1. Metoda soli holina:
Ova metoda je jedna od najčešće korištenih sintetičkih metoda. Postupite na sljedeći način:
① Prvo, L-metionin i holin reaguju u kiselim uslovima kako bi se stvorila rijetka zamjena za dušik za L-tioglutaminsku kiselinu.
② Zagrevanje i hidrolizacija azotnih supstituta u L-tioglutaminsku kiselinu u alkalnim uslovima.
Prednost ove metode je u tome što je reakcija jednostavna i laka za savladavanje, ali je prinos mali.
2. Metoda sulfonil hlorida:
Ova metoda koristi reakciju elektrofilne supstitucije za sintezu L-tioglutaminske kiseline. Postupite na sljedeći način:
① Reakcija L-metionina i sulfonil hlorida u alkalnim uslovima za dobijanje sulfinata L-tioglutaminske kiseline.
② Sulfinat se hidrolizira u alkalnim uvjetima kako bi se stvorila L-tioglutaminska kiselina.
Prednost ove metode je što je reakciju lako kontrolisati i visok prinos, ali je potrebno koristiti toksični sulfonil hlorid.
3. Metoda redukcije karbonila:
Metoda je korištenje reakcije redukcije za sintezu L-tioglutaminske kiseline. Postupite na sljedeći način:
①L-metionin reaguje sa acetoniminom i stvara piridin pirimidin-2-en-4-jedan i pirimidin pirimidin-2-en-4-jedan-5-sulfat u isto vrijeme
②Pirimidin pirimidin-2-en-4-jedan-5-sulfat se redukuje kako bi se dobila L-tioglutaminska kiselina.
4. Metoda agaroznog sulfata: Ova metoda je reakcija L-metionina i agaroznog sulfata u kiselim uvjetima kako bi se stvorila L-tioglutaminska kiselina. Zbog dobre katalitičke aktivnosti sulfata, poboljšana je efikasnost reakcije i selektivnost. Viši, ali glomazniji za rad.
U naučnim istraživanjima, detekcija L-sulforafana je veoma važna. Među njima, metoda agaroznog sulfata je jedna od klasičnih metoda detekcije. Metoda agaroznog sulfata i njeni koraci će biti detaljno opisani u nastavku.
Eksperimentalni princip
Metoda agaroznog sulfata zasniva se na formiranju žutog kompleksa L-tiogalaktopirina i barijum sulfata, soli koja se formira u kiselim uslovima, koristeći agarozu kao podlogu za odvajanje L- Metoda sulforafana. Metoda se zasniva na činjenici da u kiselim uslovima žuti kompleks nastao reakcijom barijum sulfata i L-sulforafana nije lako rastvorljiv u vodi i taloži se u agarozi, kako bi se izdvojio i detektovao L-sulforafan.
Eksperimentalni koraci:
Korak 1: Pripremite suspenziju agaroza-barijum sulfata
Izvagajte odgovarajuću količinu agaroze i barijum sulfata, dodajte određenu količinu destilovane vode nakon miješanja i dobro promiješajte, zagrijte dok se ne otopi ili ravnomjerno pomiješa, filtrirajte suspenziju pomoću filtera s veličinom pora od 0.22 um, i zatim kuvajte 3 do 5 minuta. Kada se suspenzija ohladi na ispod 50 stepeni, ali se i dalje ne stvrdne, sipajte rastvor u Petrijevu posudu i stavite je na sobnu temperaturu dok se ne stvrdne.
Korak 2: Priprema i obrada uzorka:
Izvagajte uzorak ili standard koji treba testirati, dodajte dovoljno {{0}}.01 M otopine natrijum pirofosfata da se otopi, dodajte odgovarajuću zapreminu hloroforma za ekstrakciju, centrifugirajte 10-15 minuta , ukloniti tekućinu gornjeg sloja, ispariti hloroform da bi se prikupio ostatak, dodati 2 mL vode i 2 mL koncentrovane hlorovodonične kiseline, ponovo ekstrahovati hloroformom, centrifugirati i uzet je gornji sloj. Uzmite 24 mL gornje tekućine, dodajte 0,2 mL 2-postotnog rastvora nitrata bakra i 0,4 mL 5-postotnog rastvora olovnog nitrata, ekstrahirajte jednom hloroformom, centrifugirajte i uzmite gornju tečnost koja se može koristiti kao eksperimentalni uzorak za ispitivanje.
Korak 3: Eksperiment ponovne analize:
Uzorci su dodani u suspenziju agaroza-barijum sulfata i zagrevani u vodenom kupatilu da bi se stvrdnuli na 80 stepeni 2 sata. Nakon što se uzorak očvrsne, suspenzija agaroze-barijum sulfata se ohladi na sobnu temperaturu, a kompleks agaroza-barijum sulfat-uzorak je otopljen u puferskim uslovima limunske kiseline i amonijumove soli. Na kraju, uzastopno isperite vodom i vizuelno pregledajte boju kompleksa u agaroznoj sferi.
Korak 4: Analiza rezultata:
Izmjerite apsorbanciju filtrata nakon ponovne analize da biste konstruirali standardnu krivu, čime se dobio sadržaj L-sulforafana.
Metoda agaroznog sulfata je klasična metoda za odvajanje i detekciju L-sulforafana. Kroz niz koraka, L-sulforafan se može odvojiti i otkriti njegov sadržaj. Metoda ima prednosti jednostavnosti, visoke osjetljivosti i preciznih rezultata, a obično se koristi za detekciju L-sulforafana u hrani, kozmetici i farmaceutskim proizvodima.
Sažetak: Razvojem nauke i tehnologije, metoda sinteze L-tioglutaminske kiseline se kontinuirano optimizuje i unapređuje. Istovremeno, metoda biološke fermentacije i metoda kemijske sinteze također imaju svoje prednosti i nedostatke, a koja metoda će se koristiti ovisi o stvarnoj situaciji.