Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Upoznajte streptavidin
Streptavidin (SA), protein koji se izlučuje iz Streptomyces avidinii, ima molekularnu težinu od približno 65-66 kDa i izoelektričnu tačku od oko 6,0. To je tetramerni protein sastavljen od četiri homologne podjedinice, od kojih svaka ima nezavisno mjesto za vezivanje biotina - što znači da se jedan molekul streptavidina može istovremeno vezati za četiri molekula biotina. Konstanta disocijacije (Kd) između njih je samo oko 10 ⁻¹⁵ M, što je jedna od najjačih poznatih nekovalentnih bioloških interakcija i može se smatrati najpreciznijim „mehanizmom molekularnog zaključavanja“ u prirodi.

U poređenju sa avidinom dobijenim od bjelanjaka, ima neuporedive prednosti:

Ne sadrži modifikacije glikozilacije, općenito je električno neutralan, stoga ima izuzetno nisko ne-specifično vezivanje u fiziološkim uvjetima, čistu eksperimentalnu pozadinu i odličan omjer signala-/{2}}šuma. Osim toga, njegova izvrsna otpornost na denaturaciju i razgradnju proteaze, kao i njegova sposobnost da izdrži ekstremni pH, visoke temperature (70-80 stupnjeva C), organska otapala i konvencionalna denaturirajuća sredstva (kao što su SDS i urea), zamijenili su avidin i postali neprikosnoveni "zlatni standard" u sistemima vezivanja biotina.

Upravo sa ovim izvanrednim karakteristikama blista u oblastima kao što su nauke o životu, in vitro dijagnostika, skrining lekova i biosensing.

2. Imuno testiranje
Primjena u području imunološke detekcije je njegova najklasičnija i najraširenija primjena. Od svog razvoja kasnih 1970-ih, biotin streptavidin sistem (BAS) je postao kamen temeljac imunološkog obilježavanja i analize praćenja zbog svog ultra-visokog afiniteta i efekta kaskadne amplifikacije. Prema statistikama, oko 85% uobičajenih hemiluminiscentnih analizatora koristi metode detekcije zasnovane na BAS-u, što ukazuje na njihovu dominantnu poziciju.

2.1. Enzimski imunosorbentni test (ELISA)

U ELISA testu, peroksidaza hrena (HRP) ili alkalna fosfataza (AP) se mogu spojiti i enzim se može precizno voditi do cilja putem biotiniliranih antitijela. HRP katalizira TMB, DAB ili ECL luminiscentne supstrate za proizvodnju moćnih hemijskih ili optičkih signala, dok AP katalizira BCIP/NBT, PNPP i druge supstrate za proizvodnju stabilnih signala boje ili hemiluminiscencije. Biotinilirani ciljni molekul može se vezati za višestruko obilježeni streptavidin, postižući više-pojačavanje signala i omogućavajući detekciju ciljeva niske zastupljenosti. Ova tehnologija se široko koristi u sendvič i kompetitivnoj ELISA-i, pokrivajući scenarije kao što su kvantifikacija proteina, detekcija antitijela, skrining patogena itd.

2.2 Imunoblotiranje proteina (Western blot)
U Western Blotu, vezivanje sa biotiniliranim sekundarnim antitijelima može značajno povećati intenzitet signala ciljnih proteina na transfernim filmovima. U poređenju sa tradicionalnim sekundarnim sistemima antitijela, BAS sistemi mogu postići jače pojačanje signala zbog svojih svojstava tetravalentnog vezivanja. Dodatno, zbog niskog ne-specifičnog vezivanja streptavidina, pozadinske interferencije su značajno smanjene, što ih čini posebno pogodnim za kvantitativnu analizu proteina male količine.

2.3 Imunohistohemija (IHC) i imunocitohemija (ICC)
Streptavidin označen HRP ili AP je poželjan alat za pojačavanje signala za IHC i ICC. HRP sistem je pogodan za eksperimente koji zahtijevaju izuzetno visoku osjetljivost detekcije, dok je AP sistem posebno pogodan za sisteme koji sadrže HRP inhibitore (kao što je natrijum-azid) ili eksperimentalne scenarije koji zahtijevaju dugotrajan-razvoj boja i stabilnost signala. Vezivanjem biotiniliranih sondi ili antitijela za konjugate streptavidina, ciljni molekuli se mogu precizno locirati u dijelovima tkiva ili uzorcima ćelija.

2.4 Imunofluorescencija (IF) i in situ hibridizacija (ISH)

Streptavidin označen fluoresceinom (kao što je FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) je univerzalni alat za vizualizaciju za imunofluorescentno bojenje i in situ hibridizaciju. FITC marker ima talasnu dužinu ekscitacije/emisije od približno 494/519 nm i pokazuje svetlo zelenu fluorescenciju; Talasna dužina ekscitacije/emisije PE markera je oko 565/578 nm, što je "zlatni standard" za analizu protočne citometrije u više boja; APC marker pokriva daleki crveni spektar, olakšavajući više-slikanje u boji. Ovi fluorescentni markeri mogu se precizno vezati za biotinilirana antitijela ili sonde nukleinske kiseline kako bi se postigla analiza lokalizacije i kvantitativna detekcija ciljnih molekula.

2.5 Protočna citometrija (FACS)

U protočnoj citometriji, fluorescentno obilježeni streptavidin (posebno PE označen) se koristi za otkrivanje antigena na površini ćelije obilježenih biotiniliranim antitijelima. Njegova odlična svjetlina pruža izuzetno visok omjer signala-na-šum, koji može efikasno detektovati ćelijske populacije sa niskom ekspresijom površinskog antigena ili slabim signalima. Neophodan je reagens u analizi više-protočne citometrije u boji.

2.6 Enzimski Immunospot test (ELISPOT)
Streptavidin označen AP pokazuje odlične performanse u ELISPOT-u i pogodan je za analizu čvrste{0}}faze i sisteme bojenja tkiva/ćelija. Može stabilno katalizirati proizvodnju supstrata izbrojivih spot signala za detekciju izlučivanja citokina na nivou jedne-ćelije.

3. Prečišćavanje proteina i nukleinskih kiselina
3.1 Afinitetna hromatografija i pročišćavanje proteina
Streptomicin je ključna komponenta pakovanja afinitetne hromatografije. Nakon označavanja biotinom proteina koji treba pročistiti, on se pomiješa sa streptavidin agaroznim gelom (kao što je streptavidin agaroza/sefaroza), a označeni protein će se usko vezati za streptavidin na punilu. Ispiranjem radi uklanjanja nečistoća, a zatim pranjem ciljnog proteina pod odgovarajućim uvjetima (kao što je ključanje SDS-PAGE pufera, 0,1% SDS tretman ili 95% formamid+10 mM EDTA tretman na pH 8,2), mogu se dobiti proizvodi visoke -čistoće.

Uzimajući za primjer industrijsku proizvodnju rekombinantnog humanog inzulina, visoko-kvalitetne magnetne kuglice streptavidina mogu vezati više od 1200 pmol slobodnog biotina po miligramu, a čistoća pročišćenog proteina može doseći preko 95%.

3.2 Imunoprecipitacija (IP) i imunoprecipitacija hromatina (ChIP)
Primjena magnetnih kuglica streptavidina u imunoprecipitaciji uvelike poboljšava eksperimentalnu efikasnost. Istraživači mogu fiksirati biotinilirana antitijela na magnetne kuglice streptavidina i inkubirati ih sa staničnim lizatom.

Antitijela specifično hvataju ciljni protein i njegove proteine ​​u interakciji, formirajući kompleks "ciljnog proteina antitijela magnetske kuglice". Može se brzo odvojiti pod dejstvom spoljašnjeg magnetnog polja, uz jednostavan rad i visoku osetljivost. U ChIP eksperimentima, streptavidin magnetne kuglice su također korištene za hvatanje biotiniliranih DNK proteinskih kompleksa i proučavanje interakcije između proteina i DNK.

3.3 Eksperiment povucite prema dolje
U proučavanju interakcija proteina{0}}proteina, magnetne kuglice mogu uhvatiti biotinilirane proteine ​​mamaca, a zatim "pecati" na preproteine ​​koji stupaju u interakciju s njima. Na primjer, kada se proučavaju ključni signalni putevi u tumorskim ćelijama, specifična antitijela koja prepoznaju protein P53 se imobiliziraju na magnetnim kuglicama streptavidina i inkubiraju sa lizatom tumorskih stanica kako bi se efikasno obogatio P53 i povezani proteini. U poređenju sa tradicionalnim metodama imunoprecipitacije, IP magnetne kuglice ima veću osjetljivost i specifičnost i može efikasnije obogatiti ciljne proteine ​​niske zastupljenosti.

3.4 RNA Povucite-dolje
Magnetne perle su također pogodne za eksperimente s povlačenjem RNK{0}}nadolje. Nakon vezivanja sa streptavidinskim magnetnim perlicama, biotinilirane RNK sonde mogu uhvatiti proteine ​​koji stupaju u interakciju sa RNK iz ćelijskih lizata za proučavanje mreža interakcija RNA proteina.
3.5 Priprema jednolančane DNK i ekstrakcija nukleinske kiseline
Može se vezati za biotinilirane oligonukleotide za pripremu jednolančane DNK i efikasnu ekstrakciju nukleinskih kiselina, igrajući važnu ulogu u molekularnom kloniranju i genetskom inženjeringu.

4. Visoka propusnost detekcije i skrininga lijekova
4.1. TR-FRET platforma za testiranje
Može se kombinovati sa luminiscentnim helatima kao što su kelati europijuma za izvođenje povezivanja signala i molekularnog hvatanja u sistemu detekcije TR-FRET (vremenski-prenos fluorescentne rezonantne energije). Na primjer, THUNDER™ Streptavidin označen europijumom posebno dizajniran za eksperimentalnu platformu TR-FRET može se stabilno vezati za različite biotinilirane modificirane molekule i široko se koristi u analizi interakcija proteina i preliminarnom skriningu ciljanih lijekova.

Ovaj sistem je homogen i visokog{0}}propusta, što ga čini moćnim alatom za savremeni razvoj lijekova.

4.2 Ciljana isporuka lijekova
Njegova svojstva vezivanja za biotin čine ga idealnim nosačem za sisteme za isporuku lijekova. Spajanjem molekula lijeka s biotinom i korištenjem ciljane sposobnosti vezivanja streptavidina, može se postići precizna isporuka lijeka, poboljšavajući efikasnost liječenja i smanjujući nuspojave.

4.3 Biosenzori i biočipovi

To je osnovni materijal za proizvodnju biosenzora i biočipova. Imobilizacijom streptavidina na površini čipa kao elementa za hvatanje, na njemu se mogu imobilizirati proteinske sonde ili antitijela označena biotinom, postižući visoku -propusnost i visoku- detekciju osjetljivosti. Na primjer, u ranom skriningu proteinskih čipova za kardiovaskularne bolesti, magnetne kuglice streptavidina se fiksiraju na supstrat čipa i koriste za vezivanje biotiniliranih proteinskih sondi. Ovo može precizno otkriti abnormalnosti kod pacijenata u ranim stadijumima bolesti i kada su koncentracije krvnih markera čak niže kao cTnI od 0,01 ng/mL, pomakujući dijagnostički prozor za 2-3 sata u odnosu na tradicionalne dijagnostičke metode.

5. Ćelijska biologija i slikanje
5.1 Označavanje površine ćelije i fluorescentno sortiranje ćelija
Fluorescentno označen streptavidin (kao što je Vari Fluor 488 Streptavidin) se široko koristi za označavanje površine ćelije i fluorescentno sortiranje ćelija. Njegov emisioni spektar pokriva cijeli spektar vidljivog i bliskog-infracrvenog svjetla, a u eksperimentima označavanja u više-boja, može lako ući u jezgro i citoplazmatsku strukturu, označiti ciljne proteine ​​za snimanje i analizu.

5.2 Nanotehnologija i samosastavljanje materijala
Njegova svojstva tetravalentnog vezivanja čine ga idealnim "mostom" za samo{0}}sastavljanje nanomaterijala. Kroz ciljano vezivanje biotin streptavidina, mogu se konstruirati različite nanostrukture za interdisciplinarna istraživanja kao što su biološko snimanje i praćenje okoliša.

6. Anti-streptavidin antitelo
Sa široko rasprostranjenom upotrebom streptavidin biotinskog sistema, pojavio se često zanemaren problem - endogena anti-streptavidin antitijela (ASA) u uzorku mogu ometati sistem detekcije. Istraživanja su otkrila da vezivanje ASA za SA u reakcionom sistemu može uticati na ispravnu konstrukciju sistema specifičnih antigenskih antitela, što dovodi do ugrožene tačnosti spajanja, detekcije ili dijagnostičkih rezultata.

Da bi se riješio ovaj izazov, pojavili su se kompleti za detekciju anti-streptavidin antitijela, koji se mogu koristiti za otkrivanje endogene ASA u uzorcima pacijenata i izbjegavanje njene interferencije sa BAS sistemom. Roche Custom Biotech je razvio neaktivni mutant streptavidina (Streptavidin rec. inactive, poly), koji se može dodati trenutnom sistemu bez dodatnih koraka za specifično blokiranje i eliminaciju ASA smetnji, poboljšavajući točnost i specifičnost sistema detekcije.

7. Interferencija biotina
Iako je sistem biotina streptavidin moćan, suočava se sa sve ozbiljnijim izazovom - interferencije biotina.

Kada postoji visoka koncentracija slobodnog biotina u uzorku za testiranje, on se takmiči s biotiniliranim antitijelima za mjesto vezivanja streptavidina, što rezultira iskrivljenim rezultatima detekcije.

Oralna primjena 100 mg biotina može dovesti do vršne koncentracije u plazmi od 375-450 ng/mL; Pacijenti sa multiplom sklerozom mogu uzimati 300 mg/d oralno, a nivoi biotina u plazmi mogu premašiti 1000 ng/mL; Dnevni unos od 500 mg biotina može dovesti do izuzetno visokih koncentracija biotina u krvi. U sendvič imunotestovima, prekomjerna količina biotina može dati pogrešne niske rezultate; U kompetitivnim imunotestovima, to može dovesti do pogrešnih visokih rezultata.

Brojne studije su pokazale da su TSH, tiroksin PTH, endokrini testovi kao što su adrenokortikotropni hormon, prolaktin, testosteron, kortizol, kao i tumorski markeri i srčani funkcionalni markeri, u različitom stepenu pod uticajem biotinskih interferencija. FDA je sukcesivno izdavala informacije upozorenja i odgovarajuće smjernice. Strategije suočavanja uključuju: serijsko razrjeđivanje uzoraka, prelazak na metode koje nisu BAS kao što je tečna hromatografija-masena spektrometrija, ponovno testiranje nakon uklanjanja biotina (samo 2 sata, do 15 dana ili čak mjeseci) ili korištenje slobodnih čistača biotina.