Hej, kolege entuzijasti proteina! Danas sam oduševljen da zaronim u vruću temu u svijetu proizvodnje rekombinantnih proteina: kako se količinaIPTG prahupotrijebljeni mogu u potpunosti utjecati na prinos tih oh - tako - vrijednih rekombinantnih proteina. Kao dobavljač IPTG praha, iz prve ruke sam vidio kako ovaj mali prah može napraviti ili pokvariti vašu igru proizvodnje proteina.
Prvo, hajde da brzo pređemo na ono što je IPTG. IPTG, ili izopropil β - D - 1 - tiogalaktopiranozid, je dobro poznato hemijsko jedinjenje koje se koristi kao induktor u proizvodnji rekombinantnih proteina. On oponaša prirodni induktor alolaktoze i vezuje se za lac represor, koji zatim omogućava transkripciju ciljnog gena. Jednostavnije rečeno, to je kao ključ koji otključava vrata vašim bakterijama da počnu izbacivati rekombinantni protein koji tražite.
Dakle, hajde da razgovaramo o odnosu između količine IPTG praha i prinosa rekombinantnog proteina. Općenito, možda mislite da više IPTG znači više proteina. Ali to nije tako jednostavno. To je kao pečenje torte. Dodavanje previše šećera ne čini kolač uvijek boljim; u stvari, to može upropastiti.
Niski nivoi IPTG
Kada koristite malu količinu IPTG praha, indukcija proizvodnje rekombinantnog proteina je malo sporija. Lak represor nije potpuno inhibiran, tako da se samo mali broj gena transkribuje u bilo kom trenutku. To može rezultirati nižim ukupnim prinosom rekombinantnog proteina. Ali postoje neke pogodnosti. Kao prvo, bakterije su manje pod stresom. Zamislite to kao bakterije koje imaju lako radno okruženje. Oni mogu polako i postojano proizvoditi protein, a često je vjerojatnije da će protein biti u svom ispravnom, savijenom obliku. Ovo je izuzetno važno ako tražite funkcionalni protein.
Međutim, nedostatak je što proces proizvodnje traje duže. Ako ste u žurbi da nabavite veliku količinu rekombinantnog proteina, indukcija IPTG niskog nivoa možda nije vaš najbolji izbor. Na primjer, ako radite na istraživačkom projektu osjetljivom na vrijeme u kojem trebate završiti više krugova eksperimenata sa pristojnom količinom proteina, dugo čekanje da se protein akumulira jednostavno ga neće smanjiti.
Visoki nivoi IPTG
S druge strane, upotreba velike količine IPTG-a može vam dati brz početak proizvodnje proteina. Lak represor je potpuno preopterećen, a veliki broj gena se transkribuje odjednom. To često dovodi do brzog povećanja proizvodnje rekombinantnog proteina i možete dobiti veći prinos u kraćem periodu. To je kao da bakterijama date veliki udarac u pantalone da počnu raditi prekovremeno.
Ali ovdje je kvaka. Visoki nivoi IPTG mogu biti toksični za bakterije. To ih može toliko opteretiti da počnu odumirati ili postati manje efikasni u proizvodnji proteina. Takođe, protein se možda neće pravilno savijati. Kada su bakterije bombardirane velikom potražnjom za proizvodnjom proteina, možda neće imati dovoljno vremena ili resursa da ga pravilno presavije. To može rezultirati formiranjem inkluzijskih tijela,
koji su agregati pogrešno savijenih proteina. S ovim inkluzivnim tijelima je teško nositi se jer tada morate proći kroz složen proces da otopite i ponovo savijete protein.
Pronalaženje slatkog mjesta
Dakle, kako pronaći pravu količinu IPTG praha za korištenje? Pa, zavisi od gomile faktora. Vrsta bakterije koju koristite je velika. Različiti sojevi bakterija imaju različitu osjetljivost na IPTG. Neki mogu podnijeti veću dozu bez previše stresa, dok su drugi osjetljiviji.
Uslovi rasta bakterija su takođe važni. Stvari kao što su temperatura, vrsta medija i nivoi kiseonika mogu uticati na to kako bakterije reaguju na IPTG. Na primjer, ako bakterije rastu u bogatom mediju, mogle bi biti otpornije na efekte IPTG visokog nivoa.
Još jedna stvar koju treba uzeti u obzir je priroda samog rekombinantnog proteina. Ako je protein vrlo složen ili ima puno disulfidnih veza, možda ćete htjeti koristiti manju količinu IPTG-a kako biste bakterijama dali više vremena da ga pravilno savijaju.
Kao dobavljač IPTG praha, često me pitaju za preporuke o količini koju treba koristiti. I moj odgovor je uvek: "Zavisi." Ali mogu ponuditi neke općenite smjernice. Dobro mjesto za početak je raspon koncentracije od 0,1 - 1 mM IPTG. Zatim možete napraviti neke male eksperimente da vidite kako vaš specifični sistem reagira. Isprobajte različite koncentracije unutar ovog raspona i izmjerite prinos i kvalitet proteina.
Sada, pogledajmo neke primjere iz stvarnog svijeta. U istraživačkom projektu u kojem su naučnici pokušavali proizvesti specifičan enzim, u početku su koristili nisku koncentraciju IPTG-a (0,1 mM). Prinos proteina bio je relativno nizak, ali je enzim bio visoko aktivan, što ukazuje da je bio dobro savijen. Kada su povećali koncentraciju IPTG-a na 1 mM, prinos je porastao, ali se aktivnost enzima smanjila. Dalja analiza je pokazala da je bilo više inkluzijskih tijela pri višoj koncentraciji.
U drugom slučaju, biotehnološka kompanija je proizvodila terapeutski protein. Otkrili su da su pažljivim optimiziranjem koncentracije IPTG-a na osnovu faze rasta bakterije uspjeli postići visok prinos pravilno savijenog proteina. Ovo ne samo da im je uštedjelo vrijeme, već i smanjilo troškove daljnje obrade.
Ako ste na tržištu visokokvalitetnog IPTG praha, mi smo za vas. Naš IPTG prah je čist i pouzdan, osiguravajući dosljedne rezultate u vašoj proizvodnji rekombinantnog proteina. I dok ste ovdje, pogledajte neke od naših drugih sjajnih proizvoda. Na našoj web stranici možete pronaći čisti sevofluran CAS 28523 - 86 - 6, apigenin u prahu CAS 520 - 36 - 5 i prah elagične kiseline CAS 476 - 66 - 4.
Ako imate bilo kakvih pitanja o količini IPTG praha koju ćete koristiti za svoj specifični projekt ili ako ste zainteresirani za kupovinu naših proizvoda, slobodno nam se obratite. Uvijek smo tu da vam pomognemo da optimizirate proizvodnju rekombinantnih proteina. Radimo zajedno kako bismo dobili najbolje rezultate za vaše potrebe istraživanja ili proizvodnje!
Reference
- Sambrook, J., & Russell, DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Studier, FW, & Moffatt, BA (1986). Upotreba bakteriofaga T7 RNA polimeraze za usmjeravanje selektivne ekspresije visokog nivoa kloniranih gena. Journal of Molecular Biology, 189(1), 113 - 130.
- Baneyx, F. (1999). Ekspresija rekombinantnog proteina u Escherichia coli. Biotehnologija i primijenjena biokemija, 30 (Pt 2), 101 - 106.